EdU細(xì)胞增殖成像分析試劑盒

產(chǎn)品描述
細(xì)胞增殖是評(píng)價(jià)細(xì)胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化合物中很少見(jiàn)，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復(fù)制的DNA分子中，通過(guò)基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應(yīng)，把熒光基團(tuán)標(biāo)記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣可以進(jìn)行高效快速的檢測(cè)出DNA復(fù)制活性，此技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA損傷修復(fù)等方面的研究。
傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測(cè)方法需要DNA變性、抗原修復(fù)、抗原抗體過(guò)夜孵育等復(fù)雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測(cè)方法不需要?jiǎng)×业腄NA變性，只需溫和的細(xì)胞固定化和透化處理，能夠較好地保護(hù)細(xì)胞形態(tài)、DNA整體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)抗原識(shí)別位點(diǎn)，操作步驟更加快速、靈敏和準(zhǔn)確。EdU與胸腺嘧啶(T)結(jié)構(gòu)非常相似，大小卻只有BrdU抗體的1/500，很容易在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散；無(wú)需抗原抗體反應(yīng)，能在細(xì)胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復(fù)制活性。
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產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期12個(gè)月。
使用方法（以24孔板，HK2貼壁細(xì)胞為例）
本試劑盒是采用成像檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。以下方式適用于貼壁細(xì)胞；非貼壁細(xì)胞可在孵育EdU后進(jìn)行細(xì)胞涂片處理，固定后再采用貼壁細(xì)胞的染色流程進(jìn)行檢測(cè)。
EdU標(biāo)記
1.將細(xì)胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基。
2.提前將2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后將150微升2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基與等體積細(xì)胞培養(yǎng)基混合，獲得1×EdU溶液。
【注】：①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會(huì)影響細(xì)胞增殖的速度。②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒(méi)過(guò)細(xì)胞為宜。
3.孵育細(xì)胞2 h，棄培養(yǎng)基。
【注】：①培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長(zhǎng)狀態(tài)。②大多數(shù)腫瘤細(xì)胞以及粘附細(xì)胞系均可采用2 h的孵育時(shí)間。
4.以1xPBS清洗細(xì)胞兩次，每次5 min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。
【注】：對(duì)于貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強(qiáng)度。
細(xì)胞的固定和通透
1.每孔加入150μL 4%多聚甲醛細(xì)胞固定液，室溫培養(yǎng)30 min，棄固定液。
2.每孔加入150μL 2mg/ml甘.an.suan，搖床孵育5 min，以中和過(guò)量的多聚甲醛。
3.棄甘.an.suan.溶液，每孔加入300μL PBS 洗液，室溫清洗5 min。
4.每孔加入 300μL 0.5% Triton X-100 細(xì)胞通透液，室溫通透10 min，棄細(xì)胞通透溶液。
5.每孔加入300μL PBS洗液，室溫清洗 5 min。
EdU染色
1.通過(guò)用10：1去離子水稀釋反應(yīng)緩沖液，進(jìn)行配制1×反應(yīng)緩沖液。
2.按照溶解200 mg緩沖添加劑溶于1 mL 去離子水的比例稱(chēng)取適量的粉末進(jìn)行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。
【注】：緩沖添加劑為白色粉末，較難準(zhǔn)確稱(chēng)量，稱(chēng)量范圍可稍微放寬，但是不應(yīng)超過(guò)±20%，且該粉末較易氧化，使用后請(qǐng)旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報(bào)廢或更換。
3.按照以下的表格進(jìn)行染色反應(yīng)液的配制：

4.每孔加入100 μL配置好的檢測(cè)混合液，以覆蓋細(xì)胞為宜，避光、室溫孵育30 min。
5.棄染色反應(yīng)液，加入300 μL 0.5% Triton X-100細(xì)胞滲透液清洗2-3次，每次10 min。
6.棄細(xì)胞滲透液，用PBS洗兩次，每次 5 min。
DNA染色
1.將Hoechst 33342 *超級(jí)純*（李記貨號(hào)：AC12L021）用PBS溶液1：1000進(jìn)行稀釋得到1×Hoechst染色液。
2.每孔加入150 μL 1×Hoechst染色液，室溫避光孵育20-30 min后，棄染色液。
3.每孔加入300 μL PBS洗細(xì)胞兩次，去掉洗液。
圖像獲取及分析
　　建議染色完成后立即進(jìn)行熒光顯微鏡拍照觀察；如果條件限制，請(qǐng)于4℃條件下避光濕潤(rùn)保存3 d之內(nèi)完成拍照。若為細(xì)胞爬片或涂片，可使用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片后于4℃條件下保存及拍照檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
   

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